材料與儀器

二）材料

1. 生長(cháng)成片的MDCK細胞

2. 無(wú)菌的T25細胞培養瓶

3. D-MEM培養液（含有L-谷氨酰胺）

4. 青、鏈霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸鏈霉素），分裝后保存于-20℃

5. HEPES緩沖液，1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA -胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分裝后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白組分V

9. 1mL、10mL無(wú)菌移液管

10. 70％～75％的酒精

注意事項：經(jīng)常檢查試劑使用的有效期。

實(shí)驗步驟

（三）實(shí)驗步驟

這里以T75細胞瓶的單層細胞培養為例，敘述MDCK細胞的培養程序。如果細胞瓶的規格有變，MDCK細胞懸液的量必須做相應的調整。

1. D-MEM培養液的準備
500mL D-MEM液中加入：
青、鏈霉素母液5mL（終濃度達：100U/mL青霉素；100µg/mL鏈霉素），
HEPES緩沖液12.5mL（終濃度：25mM）。
7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL
2. 細胞生長(cháng)液的準備
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液體中，使胎牛血清的終濃度為10%。
3. 首先將細胞培養瓶中的培養液棄去，加入5mL在37℃水浴中預熱的EDTA-胰酶。
4. 溫和地搖動(dòng)細胞瓶1min，使EDTA-胰酶均勻分布在整個(gè)細胞薄層。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5. 重新加入5mL在37℃水浴中預熱的EDTA-胰酶重復上述步驟。
6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均勻分布在整個(gè)細胞薄層，37℃孵育細胞瓶直至細胞從塑料細胞瓶的表面分離（約5～10min）。必要時(shí)可以搖動(dòng)或吹打來(lái)分離細胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的胰酶。
7. 加9mL已經(jīng)配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培養液，輕輕用移動(dòng)移液管來(lái)吹散細胞團。
8. 取10mL混合物加到90mL細胞生長(cháng)液（細胞懸液的濃度大約為每毫升含105細胞）
9. 每個(gè)T25細胞培養瓶加入6mL（6×105/mL）細胞懸液，剩余的細胞懸液可以加到T75細胞瓶用于細胞傳代。通常6mL細胞懸液2～3日可生長(cháng)成片（80％～90％）的單層細胞。
10. 于37℃，5%CO2培養箱里培養細胞，每天觀(guān)察細胞狀態(tài)，以供進(jìn)一步實(shí)驗用。