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    ATAC-Seq 實(shí)驗操作指南---04 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 05 明星產(chǎn)品

    發(fā)布時(shí)間: 2025-01-09  點(diǎn)擊次數: 198次

    文庫產(chǎn)出低,該不該上機?

    樣本丟失:細胞離心后在EP管中幾乎不可見(jiàn),棄去上清液時(shí)容易造成丟失。建議在細胞離心過(guò)程中,將EP管統一方向并標記細胞沉積位置,在沉淀對立面輕輕棄去上清,實(shí)驗操作過(guò)程中避免劇烈渦旋振蕩。

    不需要很糾結文庫產(chǎn)出,能夠達到上機標準的產(chǎn)出,且文庫峰型符合ATAC文庫峰型,便可以上機測序。增加擴增循環(huán)數,反而會(huì )導致dup 偏高。

     

    ATAC文庫在進(jìn)行質(zhì)檢時(shí),文庫呈現什么樣的分布是正常的分布?

    轉座酶會(huì )容易與核小體間隔部分的DNA接觸,發(fā)生打斷反應。構建成功的ATAC文庫在2100峰圖上會(huì )呈現明顯的核小體的pattern特征峰,其中:

    第一個(gè)在180-200bp的位置,屬于核小體之間的區域(40136bp

    第二個(gè)在300-400 bp

    第三個(gè)在500bp左右

    如果有第四個(gè)會(huì )在700bp附近

    核小體全長(cháng)一般在180200 bp,平均200 bp。其中,140bp是直接盤(pán)繞在組蛋白八聚體核心外面,這些DNA不易被核酸酶消化;其余為核小體間區。不同組織、細胞,同一細胞染色體的不同區段,盤(pán)繞在組蛋白八聚體核心外面的DNA長(cháng)度是不同的,如:真菌的可短至154bp、海膽精子的可長(cháng)達260bp。

     

    培養細胞進(jìn)行ATAC-seq時(shí)支原體污染嚴重,使用支原體清除劑后,細胞是否能夠繼續進(jìn)行建庫?

    支原體是原核生物,DNA呈裸露狀態(tài),當細胞被支原體感染,進(jìn)行ATAC-seq實(shí)驗時(shí),裸露的DNA會(huì )被切割,擴增。使用支原體清除劑清除后,仍會(huì )有DNA殘留,進(jìn)行ATAC-seq實(shí)驗捕獲的開(kāi)放區域占比少。存在污染時(shí),污染會(huì )被放大。

     

    Mapping 率低的原因與排查方案?

    細胞培養或取樣過(guò)程中,有時(shí)會(huì )出現樣本被外源微生物污染的情況。ATAC建庫基于Tn5轉座酶切斷開(kāi)放DNA,而微生物基因組暴露程度高,相較真核宿主基因組更易發(fā)生轉座反應。即使少量微生物污染,在所得文庫中也會(huì )占據較大比例。

    可以從以下方面進(jìn)行排查:確認細胞培養或實(shí)驗過(guò)程中有無(wú)污染;確認參考基因組是否選擇正確;分析unmapping數據比對的物種類(lèi)型。

     

    Dup Rate 值偏高分析

    Dup Rate一般與建庫中的PCR循環(huán)數相關(guān)。

    ①PCR擴增帶有一定的偏好性和錯配率,會(huì )影響最終形成文庫的覆蓋度和測序準確性;

    ②PCR本身對于不同GC含量的樣本的擴增效率是不同的,PCR循環(huán)越多,擴增困難和擴增容易的片段之間相差就會(huì )越大,對應的分子多樣性就會(huì )越低,dup就會(huì )增大;

    ③PCR本身在擴增的過(guò)程中可能會(huì )產(chǎn)生一些堿基的錯配,錯誤的擴增可能會(huì )到出現與現有相同基因的結果,導致dup值升高。因此無(wú)需為獲得更高的文庫產(chǎn)量而設置過(guò)高的擴增循環(huán)數。

     

    轉錄起始位點(diǎn)(TSS)附近的信號分布

    轉錄活躍的基因的TSS往往處于開(kāi)放狀態(tài),以保證轉錄因子可以結合。所以,NFR fragments(開(kāi)放染色質(zhì)中兩個(gè)核小體之間的LinkerDNA片段)應該富集在轉錄起始位點(diǎn)(TSS)附近(圖中黑色實(shí)線(xiàn)),而結合核小體的區域在TSS位置應該缺失且在TSS兩側相對富集(圖中紅色虛線(xiàn))。

    ATAC-seq 文庫是否可以兼容華大平臺測序?怎么做?

    ATAC文庫可以兼容 Illumina和 MGI測序,且已驗證所分析的下機數據結果一致。

    上機測序方案:ATAC文庫構建后,使用轉化試劑轉化為華大文庫,隨后進(jìn)行環(huán)化上機。

    測序策略:推薦使用PE150。PE150為雙端測序,SE50為單端測序,由PE150測序所獲得的有效片段信息較SE50更多,因此獲得的數據更優(yōu)。

     

    05 明星產(chǎn)品

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